Regulation of endocytosis in Neurospora crassa and its role in morphogenesis
El presente estudio examina aspectos fundamentales de la endocitosis como un proceso involucrado en la morfogénesis y crecimiento polarizado. Se desarrolló un procedimiento de fotoblanqueamiento basado en FRAP (por sus siglas en inglés, Recuperación de Fluorescencia Post-Fotoblanqueamiento) para med...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2022 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/3700 |
| Acceso en línea: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3700 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/autor/Neurospora crassa, endocytosis, exocytosis, subapical collar, patches info:eu-repo/classification/autor/Neurospora crassa, endocitosis, exocitosis, collar subapical, parches info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 info:eu-repo/classification/cti/310905 |
| Sumario: | El presente estudio examina aspectos fundamentales de la endocitosis como un proceso involucrado en la morfogénesis y crecimiento polarizado. Se desarrolló un procedimiento de fotoblanqueamiento basado en FRAP (por sus siglas en inglés, Recuperación de Fluorescencia Post-Fotoblanqueamiento) para medir la endocitosis en hifas de Neurospora crassa que expresan la proteína endocítica fimbrina, etiquetada con la proteína verde fluorescente (FIM-1-GFP). Se calculó que, bajo condiciones de crecimiento estándar, cerca del 12.5% de la membrana plasmática descargada en el ápice se endocita en el subápice, con una ocurrencia promedio de 21.4 eventos endocíticos/min/µm2 en un área del collar endocítico de 236.7 µm2. El procedimiento FRAP se realizó también en hifas crecidas en escasez de nutrientes y se encontró una ocurrencia promedio de 30.4 eventos endocíticos/min/µm2 en un área del collar endocítico de 79.1 µm2. Adicionalmente, se midió la internalización del reportero de endocitosis FM4-64 y se encontró los mismos valores de intensidad de fluorescencia en ambas condiciones de nutrientes. Se siguió la germinación de conidios para descifrar el establecimiento del collar endocítico utilizando las cepas FIM-1-GFP y FIM-1-mChFP/CHS-1-GFP (quitina sintasa 1). Se encontró que al principio los parches endocíticos forman una capucha en la punta del germínula y cuando el tubo germinal alcanza una longitud de ~150 µm, el arreglo de los parches comienza a cambiar a un collar subapical. Adicionalmente, se realizaron experimentos de daño mecánico en hifas maduras con el reportero de actina Lifeact etiquetado con GFP para seguir la dinámica de parches endocíticos y otras estructuras de actina de alto orden durante la regeneración de hifas y el re-establecimiento del crecimiento polarizado. Se estableció una línea de tiempo de la dinámica de las estructuras de actina de alto orden y se encontró que la remodelación de la pared celular y la membrana plasmática gracias a los parches endocíticos tiene un papel esencial en la regeneración de hifas. Adicionalmente, se visualizó a la proteína endocítica de cubierta temprana AP180 etiquetada con GFP y se observó que se localiza principalmente en el collar endocítico pero también en parches dispersos a lo largo de la hifa. Se observó el fenotipo de la cepa “knock out” Δap180 que resulta letal para las ascosporas, y otra mutante que carece del dominio N-terminal ANTH (AP180ΔANTH-GFP), la cual es incapaz de forman un collar. Y ... |
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