Caracterización molecular y análisis de expresión de genes potenciales de piruvato cinasa (pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275) en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803
Synechocystis sp. PCC 6803 es una eubacteria Gram-negativa modelopara el estudio de rutas metabólicas ya que es competente natural y presenta uncrecimiento fotoautotrófico y fotoheterotrófico en presencia de glucosa. El genomade este microorganismo se encuentra secuenciado en su totalidad, lo cual h...
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2010 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/1172 |
| Acceso en línea: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1172 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/Autor/Piruvato cinasa,Pyruvate kinase,Synechcystis sp.,Expresión de genes info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Sumario: | Synechocystis sp. PCC 6803 es una eubacteria Gram-negativa modelopara el estudio de rutas metabólicas ya que es competente natural y presenta uncrecimiento fotoautotrófico y fotoheterotrófico en presencia de glucosa. El genomade este microorganismo se encuentra secuenciado en su totalidad, lo cual hapropiciado el desarrollo de estudios in silico de transcriptomas, proteomas ymetabolomas. En el genoma de esta cianobacteria se encuentran dos secuencias,en diferentes regiones del genoma, que son potenciales de codificar para dospiruvato cinasas diferentes Pyk1 sll0587 y Pyk2 sll1275. La caracterización deestas dos secuencias es de gran importancia ya que la piruvato cinasa es la últimaenzima que interviene en una de las rutas del metabolismo del carbono de granimportancia como la glicólisis, formando piruvato y ATP a partir defosfoenolpiruvato. En este sentido resulta de gran interés el estudiar si estacianobacteria presenta uno o dos genes de piruvato cinasa, si estos estánregulados en forma diferencial, si codifican para dos isoenzimas y de ser así, siestas están controladas por reguladores alostéricos diferentes como en otrosorganismos. Con base a lo anterior el objetivo del presente trabajo fue el llevar acabo la caracterización molecular y análisis de expresión de los dos genespotenciales de piruvato cinasa (pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275) en la cianobacteriaSynechocystis sp. PCC 6803.El análisis de aminoácidos de las secuencias de Pyk1 sll0587 y Pyk2sll1275 de Synechocystis sp. PCC 6803 con secuencias de piruvato cinasa deotras bacterias mostró la presencia de sitios conservados característicos de lasenzimas Pyk. Entre los sitios conservados importantes están el sitio de unión afosfoenolpiruvato y los sitios de unión a ATP/ADP y a cationes monovalentes ydivalentes. Pyk2 presentó un extremo C-terminal largo de 99 aa como las piruvatocinasas del género Bacillus, el cual contiene un motivo de unión afosfoenolpiruvato. Pyk2 también mostró un alto grado de homología de con otraspiruvato cinasas que se activan con AMP como la de G. stearothermophilus ySynechococcus sp. PCC 6301, lo que sugiere que Pyk2 también pudiera seractivada por AMP.Para llevar a cabo la interrupción de los genes pyk se diseñaron dosmetodologías diferentes: interrupción por digestión e interrupción poramplificación. Al utilizar la metodología de digestión con enzimas de restricción nose logró la interrupción de los genes pyk probablemente debido a que se utilizaronlos genes completos, cuya secuencia podría resultar tóxica a la célula como se haencontrado en otros organismos. La metodología de amplificación consistió endiseñar oligonucleótidos con bases homólogas a los genes pyk1 sll0587 y pyk2sll1275 y bases que hibriden a casetes de resistencia a antibióticos que permitanamplificar los casetes y realizar la interrupción de los genes pyk en el cromosomade la cianobacteria por recombinación homóloga. Las amplificaciones por PCRpermitieron comprobar la interrupción de los genes pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275 yen el genoma de Synechocystis sp. PCC 6803. Sin embargo, no se lograronobtener transformantes en las condiciones de selección utilizadas (BG11+glucosay BG11+succinato). Por otro lado, se realizó el análisis de expresión de los dosgenes potenciales de piruvato cinasa por medio de RT-PCR. Las muestras fueronobtenidas de cultivos de la cianobacteria en condiciones fotoautotróficas yexponiendo los cultivos a tres diferentes condiciones (fotoautotróficas, oscuridadpor 48 horas y oscuridad por 48 horas con glucosa durante los últimos 60 minutosde incubación). La expresión del gen pyk1 sll0587 fue inducida en oscuridad y enoscuridad con glucosa, mientras que el gen pyk2 sll1275 se expresó cuandoSynechocystis sp. PCC 6803 fue cultivada en condiciones fotoautotróficas ycuando estos cultivos fueron transferidos a oscuridad en presencia de glucosa.Los resultados mostraron que la expresión de los genes pyk1 sll0587 y pyk2sll1275 se da forma diferencial. |
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